Promosi Doktor drh. Risza Hartawan, M.Phil

by | Jul 21, 2022 | Berita, Promosi Doktoral

Desain Antiviral Berbasis Small Interchange RNA dan Efikasinya Secara In Vitro Terhadap Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 Asal Indonesia

Oleh: Dr. drh. Risza Hartawan, M.Phil

Penyakit avian influenza subtipe H5N1 Asian lineage yang mulai mewabah di kawasan Asia, Afrika dan Eropa sejak tahun 1997 selain menimbulkan kerugian ekonomi yang sangat signifikan juga mengancam aspek kesehatan manusia dimana sejumlah korban meninggal dunia karena infeksi virus yang bersifat zoonosis. Faktor penting untuk mengantisipasi kasus kejadian H5N1 pada manusia adalah bahan antiviral yang efektif untuk penanganan pasien yang terinfeksi penyakit. Penanganan penyakit dilakukan dengan antiviral yang berbasis neuraminidase inhibitor, seperti Oseltamivir dan Zanamivir. Permasalahan timbul sebagai akibat mutasi beberapa strain virus menjadi resisten terhadap antiviral yang ada. Perkembangan ilmu pengetahuan memberikan alternatif dalam desain antiviral melalui RNA interference (RNAi) salah satunya adalah small interfering RNA (siRNA) yang merupakan RNA rantai pendek yang memicu terjadinya degradasi messenger RNA (mRNA) sehingga menurunkan tingkat ekspresi gen. Peredaman ekspresi gen dengan siRNA mempunyai prospek sangat baik sebagai antiviral karena sifatnya yang sangat poten dan spesifik terhadap gen tertentu. Desain siRNA yang relatif mudah dan fleksibel terhadap perubahan. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan desain antiviral alternatif berbasis siRNA terhadap gen nucleoprotein yang lebih sesuai terhadap virus avian influenza subtipe H5N1 yang bersirkulasi di Indonesia.

Desain siRNA dilakukan secara in silico dengan program siDirect 2.0 berdasarkan sekuen gen nucleoprotein virus H5N1 yang bersirkulasi di Indonesia. Dua kandidat siRNA- NP672 dan siRNA-NP1433 dipilih berdasarkan kajian bioinformatik. Selanjutnya, kedua kandidat siRNA-NP tersebut ditantang secara in vitro pada sel Mabin-Darby canine kidney (MDCK) terhadap virus H5N1 asal Indonesia clade 2.1.3 dan 2.3.2 dengan menggunakan siRNA-NP1496 sebagai pembanding. Paramater yang diamati adalah produksi virus dan ekspresi gen virus. Terakhir, analisa mutasi gen nucleoprotein virus H5N1 dilakukan untuk melihat paparan siRNA-NP secara berulang kali.

HPAI subtipe H5N1 baik clade 2.1.3 dan 2.3.2 secara in vitro pada sel MDCK yang dicerminkan dengan titer produksi virus dibandingkan dua desain lainnya yaitu siRNA- NP1433 dan siRNA-NP1496. Pemberian siRNA-NP672 juga memberikan efek peredaman yang lebih tinggi dan konsisten terhadap ekspresi gen-gen virus, antara lain nucleoprotein, polymerase acidic, hemagglutinin, neuraminidase, Matrix, dan non- structural. Hasil kajian bioinformatik terhadap struktur sekunder dan tersier RNA gen nucleoprotein menunjukkan bahwa target siRNA-NP672 lebih berinteraksi karena memiliki bagian bebas (loop) yang lebih banyak dibandingkan dua kandidat siRNA-NP lainnya. Selanjutnya, eksposure siRNA-NP sebanyak 3 seri paparan pada infeksi virus H5N1 baik clade 2.1.3 dan clade 2.3.2 secara in vitro pada sel MDCK tidak memicu terjadinya mutasi gen nucleoprotein, terutama pada situs penempelan siRNA. Berdasarkan hasil penelitian diatas, maka dapat disimpulkan bahwa kandidat siRNA- NP672 menunjukkan prospek yang lebih baik dalam menurunkan tingkat infeksi virus avian influenza subtipe H5N1 baik clade 2.1.3 dan clade 2.3.2 dibandingkan 2 kandidat lainnya, yaitu siRNA-NP1433 dan siRNA-NP1496.

Hasil   penelitian   menunjukkan   bahwa   kandidat   siRNA-NP672   memberikan   efek penurunan infeksi virus H5N1 yang lebih baik dalam menurunkan tingkat infeksi virus

Rencana penelitian di masa mendatang antara lain pemetaan genetik virus influenza dengan kajian bioinformatik untuk menemukan kandidat siRNA pada gen-gen virus influenza lainnya yang berguna dalam aplikasi beberapa siRNA secara bersamaan dengan sistem koktail. Selain itu perlu dilakukan kloning kandidat siRNA-NP672 pada vektor kloning yang sesuai untuk keperluan paten. Pemilihan sistem delivery yang tepat untuk menghantarkan siRNA ke sel target, terutama untuk tahapan penelitian lanjutan, seperti uji uji tantang secara in vivo pada hewan coba yang sesuai.

drh. Risza Hartawan, M.Phil Doctoral Promotion

by | Jul 21, 2022 | Berita, Promosi Doktoral

Antiviral Design Based on Small Interchange RNA and Its Efficacy In VitroAgainst Avian Influenza Virus Subtype H5N1 From Indonesia

By: Dr. dr. Risza Hartawan, M. Phil

The avian influenza subtype H5N1 Asian lineage which began to endemic in Asia, Africa, and Europe since 1997 in addition to causing very significant economic losses, also threatened human health aspects where several victims died due to zoonotic viral infections. . An essential factor for anticipating cases of H5N1 occurrence in humans is an effective antiviral agent for treating patients infected with the disease. Treatment of the disease is carried out with antiviral-based neuraminidase inhibitors, such as Oseltamivir and Zanamivir. Problems arise as a result of mutations in several viral strains becoming resistant to existing antivirals. The development of science provides an alternative in antiviral design through RNA interference (RNAi), one of which is small interfering RNA (siRNA), which is a short chain RNA that triggers messenger degradation. RNA (mRNA) thereby lowering the level of gene expression. Attenuation of gene expression with siRNA has very good prospects as an antiviral because it is very potent and specific to certain genes. Relatively easy and flexible siRNA design to change. This study aims to design an alternative siRNA-based antiviral against the nucleoprotein gene that is more suitable for the avian influenza subtype H5N1 virus circulating in Indonesia.

The siRNA design was carried out in silico with the direct 2.0 program based on the H5N1 virus gene sequence circulating in Indonesia. Two candidates siRNA-NP672 and siRNA-NP1433 were selected based on bioinformatics studies. Furthermore, the two candidate siRNA-NPs were challenged in vitro on Mabin-Darby canine kidney (MDCK) cells against H5N1 viruses from Indonesia clade 2.1.3 and 2.3.2 using siRNA-NP1496 as a comparison. The observed parameters were virus production and viral gene expression. Finally, mutation analysis of the nucleoproteinvirus of the H5N1 virus was carried out to observe repeated siRNA-NP exposure.

HPAI subtype H5N1 both clade 2.1.3 and 2.3.2 in vitro on MDCK cells reflected by the titer of virus production compared to two other designs, siRNA-NP1433 and siRNA-NP1496. Administration of siRNA-NP672 also provided a higher and consistent attenuation effect on the expression of viral genes, including nucleoprotein, acidic polymerase, hemagglutinin, neuraminidase, Matrix, and non-structural. The results of a bioinformatic study of the secondary and tertiary structures of RNA nucleoprotein genes showed that the target siRNA-NP672 interacted more because it had more free (loop) parts than the other two siRNA-NP candidates. Furthermore, siRNA-NP exposure in 3 series of exposure to H5N1 virus infection both clade 2.1.3 and clade 2.3.2 in vitro in MDCK cells did not trigger nucleoprotein gene mutations, especially at the siRNA attachment site. Based on the study’s results above, it can be concluded that the siRNA-NP672 candidate shows better prospects in reducing the infection rate of avian influenza virus subtype H5N1 both clade 2.1.3 and clade 2.3.2 compared to the other 2 candidates, namely siRNA-NP1433 and siRNA-NP1496.

The results of the study showed that the candidate siRNA-NP672 had a better effect on reducing H5N1 virus infection in reducing the rate of viral infection

Future research plans include genetic mapping of influenza viruses with bioinformatics studies to find siRNA candidates in other influenza virus genes that are useful in the application of several siRNAs simultaneously with cocktail systems. In addition, it is necessary to clone the candidate siRNA-NP672 on an appropriate cloning vector for patent purposes. Selection of the right delivery system to deliver siRNA to target cells, especially for advanced research stages, such as challenge tests in vivo in appropriate experimental animals.

Ready to Help You